自荷蘭博物學(xué)家、顯微鏡創(chuàng)制者Antonie van Leeuwenhoek(1632-1723)在17世紀(jì)次將光線通過透鏡聚焦制成光學(xué)顯微鏡并用它觀察微生物(microorganisms or animalcule)以來，顯微鏡就一直是生物學(xué)家從事研究工作、探尋生命奧秘必不可少的利器。正是因為有了Leeuwenhoek的這項偉大發(fā)明及其后繼者對顯微鏡技術(shù)的不斷改進(jìn)和發(fā)展，人們才能夠?qū)?xì)胞內(nèi)部錯綜復(fù)雜的亞細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)的形態(tài)有了初步的了解。

      此后，研究人員對顯微鏡技術(shù)的追求從未停歇過，他們總是希望能得到分辨率更高的顯微鏡，從而更好地觀察細(xì)胞內(nèi)部更細(xì)微的結(jié)構(gòu)。近，《自然-方法》(Nature Methods)雜志上報道的超高分辨率成像技術(shù)(super-resolution imaging, SR imaging)終于使得人們可以在單分子水平上進(jìn)行觀察研究。

　　SR技術(shù)的發(fā)展過程

　　在達(dá)到今天SR技術(shù)水平的過程中，承載了許許多多研究人員辛勤勞動的汗水，也面臨著諸多亟待解決的難題。

       在以上這些光學(xué)SR成像技術(shù)中有兩種技術(shù)——受激發(fā)射減損顯微鏡(stimulated emission depletion microscopy, STED)和飽和結(jié)構(gòu)光學(xué)顯微鏡(saturated structured illumination microscopy，SSIM)受關(guān)注。

　　近，基于探針SR成像技術(shù)的光敏定位顯微鏡(PALM)和隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡(STORM)，以及借助熒光基團(tuán)隨機(jī)激活特性的熒光光敏定位顯微鏡(FPALM)都已經(jīng)取得了成功。

　　通過基于探針的SR成像技術(shù)，可以獲得多張原始圖像。在每一張原始圖像中，細(xì)胞內(nèi)只有一部分被熒光標(biāo)記的分子能發(fā)出熒光，即這些熒光分子都處于不斷激活和滅活的交替狀態(tài)，每一次都只有部分分子能被觀察并成像。而且由于每次發(fā)出熒光的分子都分散得較為稀疏，因此相互之間不會受到影響，也就避免了因相鄰分子發(fā)出熒光而無法分辨的問題。后將這些原始圖片疊加、重合在一起就得到了終的高分辨率圖像。這樣，就能使得那些以前由于熒光點太密以至于無法成像的結(jié)構(gòu)的分辨率達(dá)到納米級水平，而且成像的分子密度也相當(dāng)高，可以達(dá)到105個分子/μm2。

　　這種分辨率對于生物學(xué)家來說，意味著現(xiàn)在可以在分子水平上觀察細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)及其動態(tài)過程了。

       雖然顯微鏡技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到了如此高度，但它仍然只是生物學(xué)家研究中使用的一種工具。因此還需要將顯微鏡獲得的圖像與其它的試驗結(jié)果互相參照，才能獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。人們需要認(rèn)清SR顯微鏡的優(yōu)勢與劣勢，為操作以及判斷SR圖像制定出標(biāo)準(zhǔn)化的操作規(guī)范，只有這樣才能大限度地發(fā)揮SR顯微鏡的作用。

　　現(xiàn)在，由于人們對細(xì)胞內(nèi)各組份的組織結(jié)構(gòu)以及它們的動態(tài)變化過程都只有一個概念上的認(rèn)識，因此，借助顯微鏡從納米水平上對這些結(jié)構(gòu)及過程進(jìn)行真實的觀察能讓人們發(fā)現(xiàn)許多以往所不了解的東西。例如，以前人們通過電鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞骨架是由大量絲狀網(wǎng)格樣組織構(gòu)成時，就有人對此現(xiàn)象持懷疑態(tài)度。那些認(rèn)為細(xì)胞骨架是一種用來稀釋細(xì)胞內(nèi)生化物質(zhì)濃湯這樣一種結(jié)構(gòu)的細(xì)胞生物學(xué)家把這種觀測結(jié)果稱作僵化的人為試驗結(jié)果。

　　除非新的SR顯微鏡圖像或者其它的試驗結(jié)果都能證明細(xì)胞骨架是由大量的絲狀網(wǎng)格樣組織構(gòu)成的，否則還會有人持上述的懷疑觀點。不過已經(jīng)有其它的生化試驗結(jié)果證實了早期的電鏡觀察結(jié)果是正確的。當(dāng)然新興的SR技術(shù)也需要其它傳統(tǒng)的生化試驗結(jié)果予以佐證才有價值，同時還需要電鏡的輔助。因為電鏡能提供納米級的觀察結(jié)果，這對于佐證具有同樣分辨率的SR顯微鏡觀測結(jié)果來說是有價值的。

　　今后，大家在逐步了解、接受和廣泛使用SR顯微鏡的同時，需要注意將會出現(xiàn)的各種問題，以下的表格列出了部分與SR顯微鏡使用相關(guān)的缺點及其目前的解決方法。

       近幾年，就如何處理圖像已經(jīng)有了非常嚴(yán)格的操作規(guī)范。不過迄今為止，對于怎么處理SR圖像還沒有一個標(biāo)準(zhǔn)的操作規(guī)范。尤其需要指出的是，PALM和STORM數(shù)據(jù)在某些重要因素上，graph方面的共性要多于image方面。在一張SR圖像上，分子的不確定性和密度都能用顏色表示出來，這種圖像把細(xì)胞內(nèi)該分子有可能出現(xiàn)的任何地點都標(biāo)示出來了。而且只有被標(biāo)記的分子按照一定的標(biāo)準(zhǔn)(發(fā)出的光子數(shù))判斷它的確是一個單分子并且定位準(zhǔn)確之后才顯示出來。必須對獲得的圖像進(jìn)行這樣的標(biāo)準(zhǔn)化處理之后才能分析結(jié)果。同樣，對于試驗數(shù)據(jù)也需要如此進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。要提高分辨率不僅需要分子定位、分布得比較好，還需要分子數(shù)目夠多，以致能達(dá)到尼奎斯特判斷法(Nyquist criterion)的要求，即分子間的平均距離要小于顯微鏡分辨率的一半。雖然上述問題都不會影響SR顯微鏡的應(yīng)用，但由于存在這些問題，所以我們應(yīng)該時刻提醒自己，一定要仔細(xì)判讀、分析SR顯微鏡的圖像結(jié)果，只有這樣才能得到有價值的生物學(xué)結(jié)論。